期待 生命中的彩虹

參展類別：生物
作品編號：B20
作品名稱：環境荷爾蒙對血糖調控的影響
參展者姓名：二良陸虹亦、鄭芳渝
指導老師：劉興華教授、胡苓芝老師


摘要

        現代的環境中，存在相當多的環境毒素，有些具有紊亂我們的荷爾蒙分泌的，我們稱之為環境荷爾蒙(Endocrine disrupting substances，簡稱EDS)。我們想針對其對血糖調控的影響及反應機制進行研究。
        
        實驗初步是選取Cd、As、HgCl2、MeHg、Tributyltin、Genistin、Diosgenin等環境荷爾蒙測試其對胰島細胞分泌insulin的影響，最後選用Tributyltin、Anthracene進行下一階段的研究。由每日定量腹腔注射Tributyltin和Anthracene兩種毒物的結果，可發現小鼠的血糖值會降低，但同時體内的胰島素濃度卻無明顯差異，因此我們推測這種結果可能和細胞膜上「葡萄糖運輸蛋白」有關，或許是此兩種環境荷爾蒙會促使更多的GLUT4釋放到細胞表面，讓葡萄糖和GLUT4的結合機會增加，導致血液中的葡萄糖濃度降低，所以才會觀察到有低血糖的情形。故我們將進一步利用西方墨點法，探討小鼠細胞膜上「葡萄糖運輸蛋白」的變化，期望能確實找出導致小白鼠血糖降低的真正機制。

壹、研究動機

一、研究背景(3)

        環境荷爾蒙，是一類現代工業產物，例如農藥，界面活性劑，塑膠原料等化學物質。又稱為外因性內分泌干擾物質，簡稱EDS。它透過食物鏈進入人體，一方面會形成「假性荷爾蒙」產生類似荷爾蒙的作用，另一方面影響本來身體內荷爾蒙的量，這二者皆會干擾內分泌原來的機制，特別是生殖功能方面，如男性精子減少。女性子宮內膜症及不孕症者增加，免疫系統失調等。

        一般農藥及重金屬的污染程度以ppm（百萬分之一）為單位，而荷爾蒙的作用是以ppb（十億分之一）為單位，但是環境荷爾蒙的污染程度又是其一萬分之一ppt（一兆分之一）！ 更可見環境荷爾蒙的影響力。

         Anthracene，又稱蒽，屬於多環芳香族，碳氫化合物PAH的一族，具有不易分解、微揮發性、生物濃縮性與生物蓄積性等特性，常用於工業上，被使用在紅色染料alizarin〈茜素染料)的人為生產。會經由食物鏈而進入人體。

        Tributyltin，又稱三丁基錫或TBT，有機錫化合物有4種類型：四烴基錫化合物（R4Sn）、三烴基錫化合物（R3SnX）、二烴基錫化合物（R2SnX2）和一烴基錫化合物（RSnX3），有機錫化合物多為固體或油狀液體，易揮發。不溶或難溶於水，易溶於有機溶劑。

        有機錫化合物主要用作聚氯乙烯塑膠穩定劑，也可用作農業殺菌劑、油漆等的防黴劑、水下防汙劑、防鼠劑等。TBT常被添加漁船柏油漆中，以防止貝類附著，也常添加於工業用水中，具毒性，為我國公告毒性物質之一。

        有機錫化合物種類繁多，其毒性及毒作用靶器官不一。三丁基錫等為皮膚或粘膜的強刺激劑，急性三丁基錫中毒之臨床表現症狀似急性三乙基錫中毒，但病情較輕。主要為腦水腫及顱內壓增高。


二、研究動機
    此次實驗是針對環境毒素對血糖的影響，對於環境荷爾蒙對血糖與胰島素的影響的研究並不多，曾有報告指出在in vivo實驗，可觀察到動情素具有胰島素正向效應(insluinotropic effect)；且在初級培養的小鼠胰臟細胞實驗也證實17β-estradiol具有快速胰島素正向效應(1)；但是Horn等人(2000)在overexpressing estrogen receptors的INS-1 cells的研究，卻顯示17β-estradiol不具胰島素正向效應(2)，這兩種說法非常極端。而有關環境荷爾蒙對於胰臟β-細胞胰島素釋放及血糖調節上影響的研究，則相對地佷少。
並且，因為Anthracene、Tributyltin這兩種物質不常被探討其對血糖的影響，但這兩種物質卻真實存在於環境裡，所以我們對此感到好奇，想針對它們跟血糖的反應機制下手，以及其對胰島素的分泌造成的反應。

貳、研究目的
（一） 利用腹腔注射方法，使小白鼠處在毒物環境下，研究其血糖與胰島素的變化與影響。
（二） 利用西方墨點法研究其對血糖影響的真正原因，排除胰島素影響的可能與否。
（三） 以細胞層級探討其反應機制及原理。

參、研究設備及器材
一、細胞實驗
（一）無菌操作臺
（二）細胞培養箱
（三）光學顯微鏡

二、ELISA必需器材
（一）25 μl micropipette with disposable tip
（二）EIA plate reader with 450 nm filter
（三）Wash device for microtitration plates
（四）50 μl and 200 μl repeating pipettes
（五）Tube(10-100 ml) for preparation of Conjugate
（六）Redistilled water
（七）1000 ml / 10 l bottle
（八）Plate shaker
（九）Coated Plate
（十）Calibrator 0 (colour coded yellow)
（十一）Enzyme Conjugate 11X
(Peroxidase conjugated mouse monoclonal anti-insulin, 4.4μg/l)
（十二）Enzyme Conjugate Buffer (colour coded blue)
（十三）Wash Buffer 21X
（十四）Substrate TMB
（十五）Stop Solution (0.5M H2SO4)
（十六）eppendorff
（十七）採血針(毛細管)
（十八）離心機 Centrifuge 5415R
（十九）可調式分注器

三、測驗血糖值必需器材
（一）採血針(毛細管)
（二）eppendorff
（三）OneTouch^TM SureStep^TM meter(血糖機)
（四）血糖試紙

四、I.P.必需器材
（一）1c.c.針筒數支
（二）Tributyltin bromide (來源：Aldrich Chemistry)
（三）Anthracene(來源：Sigma)
（四）eppendorff
（五）玉米油
（六）DMSO(二甲基亞楓，Dimethyl Sulfoide，來源：Riedel-de Haen)
（七）生理食鹽水
（八）手套
（九）pipetman＋tips

五、Sacrifice必需器材
（一）解剖工具
（二）剪刀
（三）微量天秤
（四）eppendorff

肆、研究過程及方法
一、尋找適當的環境荷爾蒙
    選取Cd、As、HgCl2、MeHg、Tributyltin、Genistin、Diosgenin等環境荷爾蒙，初步測試其對胰島細胞分泌insulin的影響。
（一） 先至細胞培養箱內取出已經培養好的胰島細胞，使用顯微鏡觀察細胞。
（二） 於無菌操作台，先清洗細胞原已產生的insulin，將培養液吸掉，再清洗每一個well。最後吸掉清洗液，加入培養液。
（三） 將各類環境荷爾蒙配置好裝在eppendorff內，取2.5μ的環境荷爾蒙注射至cells中（每一組有3個wells）。
（四） 結束後蓋子過火消毒蓋上，放回培養皿內（≒37℃，CO2 2~5%）。
（五） 等待細胞反應約2~4小時。
（六） 2小時後取出，將各well中的細胞和培養液分注到Coated Plates的well中。準備測insulin值，其方法利用ELISA。
（七） 利用十二爪可調式分注器將Enzyme Conjugate 11X分注50μl到每個well中，顏色呈藍色。
（八） 放到shaker，蓋上鋁箔紙，shake兩小時。
（九） 兩小時後，進行Wash動作。利用wash buffer清洗未作用的enzyme，反覆6次。
（十） 注入Substrate TMB 200μl(透明色)。Shake 15分鐘。
（十一）注入Stop Solution 50μl停止反應，液體由藍變黃。
（十二）將sample放入Microplate Reader讀取吸光值。

二、每日定量I.P.
    首先去動物中心採購數隻ICR mice（雌），並將mice分成三組：分別為control組、注射TBT組、注射Anthracene組。
（一）TBT
1. 注射濃度為10mg/kg，其溶劑為DMSO。
2. 每日給予小白鼠I.P.（腹腔注射），定期紀錄體重及測血糖basal值。
（二）Anthracene
1. 注射濃度為10mg/kg，其溶劑為玉米油。
2. 每日給予小白鼠I.P.（腹腔注射），定期紀錄體重及測血糖basal值。

三、測blood sugar
（一）Non-fasting（未禁食）
1. 利用毛細管採小白鼠的眼窩血，滴入試紙的粉紅測試區，使血液中的葡萄糖與試紙中的化學成分發生反應，使試紙變藍。
2. 將試紙插入血糖機(OneTouchTM SureStepTM meter)，讀取藍色的深淺程度，並確定血液中的血糖值，血糖機上顯示的結果為血漿血糖值。系統的「血漿校正」可以將全血血糖值轉換成血液中血漿的對應血糖值。
3. 紀錄血糖basal數值。
（二）Fasting（禁食13~16小時）
1. 利用毛細管採小白鼠的眼窩血。
2. 將試紙插入血糖機(OneTouchTM SureStepTM meter)，將全血血糖值轉換成血液中血漿的對應血糖值。
3. 紀錄血糖basal數值。
4. I.P. Glucose(濃度為1mg/1g mouse)。
5. 15分鐘後測其血糖變化值，並做紀錄。
6. 每隔30分鐘測血糖值，重複4次左右。
7. 整理數據，做成圖表，以觀察其變化趨勢。

四、測小白鼠insulin值（ELISA）
（一）利用毛細管取mice眼窩血0.5㏄，裝在eppendorff內標上記號。
（二）利用離心機，設定4℃、3000rpm，離心10分鐘。
（三）十分鐘後，取出eppendorff，每個sample抽出25μl血清至Coated Plate的well中。
（四）將Enzyme Conjugate 11X分注50μl到每個well中，顏色呈藍色。
（五）放到shaker，蓋上鋁箔紙，shake兩小時。
（六）兩小時後，進行Wash動作。利用wash buffer清洗未作用的enzyme，反覆6次。
（七）注入Substrate TMB 200μl(透明色)。Shake 15分鐘。
（八）注入Stop Solution 50μl停止反應，液體由藍變黃。
（九）將sample放入Microplate Reader讀取吸光值。
（十）利用EXCEL把O.D.值轉成concentration值。

五、Sacrifice
（一）準備好解剖器具。
（二）利用「斷頭法」處理小白鼠，並把血放掉，以免影響器官的重量。
（三）取出腦、心、肝、腎、子宮，並秤其重量。
（四）另外取出腿上的紅肌和白肌各兩條，存放-70℃冰箱，日後做西方墨點法。
（五）紀錄各器官重量，觀察其相異處，並檢查子宮增生情況。

伍、討論
一、預期假設
        由於我們的預估為注射Anthracene、TBT的老鼠將會罹患糖尿病，此為一血糖較高、β細胞分泌胰島素較少的疾病，所以期望看到注射Anthracene、TBT的老鼠會有比control高的血糖值、比其低的胰島素值。

二、前驅實驗
        第一批老鼠做出與期望相反的數據，注射Anthracene、TBT的老鼠有血糖值比control低、胰島素值比其高。
        初步推斷老鼠內的胰島素可能會被此兩種毒物催生而增加，導致血糖值較低。不過如果胰島素分泌一直偏高，也有可能會導致胰島素抗性而造成糖尿病。然而這需要長時間、低劑量的持續施藥，故並沒有看出此種現象。
        因此我們改變先前的假設，重作一批新鼠，期望看到注射Anthracene、TBT的老鼠會有比control低的血糖值、比其高的胰島素值。證實此兩種藥物具有催生胰島素的能力。
此外，由於有施打藥物的前驅實驗老鼠的子宮有明顯增生現象，證實此兩種藥物具有所謂環境荷爾蒙的特質。

三、重覆實驗
        第二批老鼠隻數較前驅實驗多了一倍，以期數據更為精確。
        此次實驗數週後，老鼠之血糖值與血糖曲線如期降低，證實此兩種藥物確實有使血糖值變低的能力。
        然而第一次Anthracene、control測量出的胰島素卻意外的沒有顯著分別，甚至Anthracene的還微低，暫定此種結果可能是實驗誤差。
        但第二次測量Anthracene、TBT、control時，胰島素值竟以control最高，Anthracene次之、TBT更次，完全推翻了前次的理論。因此我們重新檢討了理由，推測可能影響老鼠血糖值的並不是胰島素的關係。此兩種藥物確實回造成血糖降低，但並不會明顯影響到胰島素的分泌。
        我們曾經懷疑過可能是時間的關係，或許這兩種環境荷爾蒙必須在長時間的影響下才會有對胰島素明顯的影響。但是由於觀察的時間有限，所以我們考慮從別的因素進行探討。
        我們推測這樣的結果很有可能和「葡萄糖運輸蛋白」有關。葡萄糖運輸蛋白(glucose transporter)，簡稱GLUT，大概分為十幾種，目前完全了解機制的只有一、二、三、四、五型，其中和肌肉有關的為GLUT4，是一種insulin-sensitive型的glucose transporter，平常多是以囊泡的方式存在於細胞中，當血液中有insulin存在的時候，就會釋放GLUT4到細胞表面，將葡萄糖運送入肌肉細胞，儲存成肝糖。
        因此，我們想或許是此兩種環境荷爾蒙會促使更多的GLUT4釋放到細胞表面，讓葡萄糖和GLUT4的結合機會增加，導致血液中的葡萄糖濃度降低，所以才會觀察到有低血糖的情形。因此我們接下來預定要利用「西方墨點法」，來進行檢測小白鼠腿部肌肉細胞之GLUT4的量，以證實我們的假設。

陸、結論
        經過長時間的觀察與紀錄，我們證實了Anthracene和TBT兩種藥物確實有促使體內血糖降低的作用，但是實際原因與機制尚未得知，必須再經一些測試才能確切下結論。器官重量數據也顯示注射環境荷爾蒙的小白鼠子宮重量有明顯的增加，尤以TBT的為甚。而注射TBT的小白鼠似乎有神經方面的不適，變的比較神經質，我們推測TBT也有神經方面的副作用。對於血糖下降的真正原因，我們將進一步深入探討。

柒、參考資料及其他
一、 Nadal A, Rovira JM, Laribi O, Leon-quinto T, Andreu E, Ripoll C, Soria B. (1998) Rapid insulinotropic effect of 17beta-estradiol via a plasma membrane receptor. FASEB J. 12:1341-1348.
二、 Horn PA, Mohlig M, Osterhoff M, Wolter S, Hofmann J, Stocking C, Ostertag W, Wahl M, Schatz H, Pfeiffer A. (2000) Effect of estradiol on insulin secreting INS-1 cells overexpressing estrogen receptors. Eur J Endocrinol. 142:84-91.
三、 
http://www.chem.ccu.edu.tw/~cyhung/web-highschool-2/Chapter-b4/Chapter-b4.htm
http://www.gdpcc.com/toxi/toxi10.htm
行政院農業委員會農業藥物毒物試驗所技術專刊第132號。
四、Campbell‧Reece（2005）。生物學（第六版）。偉明圖書。
五、Wikipedia, 線上維基百科。